大牛张锋亲自解读六大CRISPR问题 |基因编辑入门科普

博德研究所官网更新了关于CRISPR六大问题与答案,大牛张锋亲自解读,小编略作编译,供大家参考:

什么是“ CRISPR”?

答:“CRISPR”代表簇状规则间隔的短回文重复序列,这是构成CRISPR-Cas9基因组编辑技术基础的细菌防御系统的标志。在基因组工程领域,术语“CRISPR”或“CRISPR-Cas9”通常被宽松地使用来指代各种CRISPR-Cas9和-CPF1(及其他)系统,这些系统可被编程为靶向特定的遗传密码片段以及在精确位置以及其他目的(例如用于新的诊断工具)上编辑DNA。

利用这些系统,研究人员可以永久性地修饰活细胞和生物体中的基因,并且将来可能使纠正人类基因组精确位置的突变成为可能,从而治疗疾病的遗传原因。现在还可以使用其他系统,例如CRISPR-Cas13等。

CRISPR来自何方?

答:CRISPR是由西班牙阿利坎特大学的科学家Francisco Mojica 首次在古细菌中发现(后来在细菌中发现的)。他提出,CRISPRs可以作为细菌免疫系统的一部分,防御入侵的病毒。它们由重复的遗传密码序列组成,并被“间隔”序列打断-过去入侵者留下的遗传密码残留物。

该系统可作为遗传记忆,帮助细胞在入侵者返回时检测并摧毁它们(称为“噬菌体”)。Mojica的理论在2007年由Philippe Horvath领导的一组科学家进行了实验证明。

2013年1月,张锋实验室发布了第一种工程改造CRISPR的方法来编辑小鼠和人类细胞中的基因组。

有关从最初的发现到CRISPR介导的基因组编辑的首次演示为促进CRISPR系统的理解和开发做出贡献的许多科学家和团队的更多信息,请访问我们的CRISPR研究简史(见文末)。

CRISPR系统如何工作?

答:CRISPR“间隔子”序列被转录为短RNA序列(“CRISPRRNA”或“crRNA”),能够指导系统匹配DNA序列。当找到目标DNA时,Cas9(一种由CRISPR系统产生的酶)与DNA结合并切割,从而关闭了目标基因。使用Cas9的修改版,研究人员可以激活基因表达,而不用切割DNA。这些技术使研究人员能够研究基因的功能。

研究还表明,CRISPR-Cas9可用于靶向和修饰人类基因组中30亿个字母的序列中的“typos”,以治疗遗传疾病。

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艺术家对CRISPR系统的描述。来源:Stephen Dixon

与其他基因组编辑工具相比如何?

答:事实证明,CRISPR-Cas9是其他现有基因组编辑工具的有效且可定制的替代方案。由于CRISPR-Cas9系统本身能够切割DNA链,因此CRISPR与其他工具一样无需与单独的切割酶配对。它们也可以轻松地与量身定制的“引导” RNA(gRNA)序列相匹配,这些序列旨在将其引导至其DNA靶标。已经创建了成千上万的此类gRNA序列,可供研究团体使用。CRISPR-Cas9还可以用于同时靶向多个基因,这是另一个使其与其他基因编辑工具区分开的优势。

CRISPR-Cpf1与CRISPR-Cas9有何不同?

CRISPR-Cpf1与先前描述的Cas9在几个重要方面有所不同,对研究和治疗具有重要意义。

首先,DNA切割酶Cas9以其天然形式与两个小RNA形成复合物,这两个小RNA都是切割活性所必需的。Cpf1系统更简单,因为它仅需要一个RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9小,从而更易于传递到细胞和组织中。

其次,也是最重要的一点,Cpf1以不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时,它会在同一位置切割两条链,留下“平末端”,这些末端通常在重新结合时会发生突变。使用Cpf1复合物时,两条链上的切割是错位的,在暴露的末端留下短的突出端。预期这将有助于精确插入,从而使研究人员可以更有效,更准确地整合DNA片段。

第三,Cpf1切割距离识别位点很远,这意味着即使目标基因在切割位点发生突变,它也可能仍会被重新切割,从而允许进行正确编辑的多种机会。

第四,Cpf1系统为选择目标站点提供了新的灵活性。与Cas9一样,Cpf1复合物必须首先连接到称为PAM的短序列,并且必须选择与天然PAM序列相邻的靶标。Cpf1复合体识别与Cas9不同的PAM序列。这可能是靶向疟疾寄生虫基因组甚至人类基因组的优势。

CRISPR还能有其他科学用途吗?

答:CRISPR基因组编辑使科学家能够快速创建细胞和动物模型,研究人员可利用它们来加快对癌症和精神疾病等疾病的研究。此外,CRISPR正在被开发为一种快速诊断工具。

为了在全球范围内鼓励这类研究,张峰及其团队通过直接教育并与世界各地的学术实验室共享了40,000多个CRISPR组件,对CRISPR基因组编辑技术的使用培训了数千名研究人员。

CRISPR研究简史

CRISPR的发现及其功能
1993年至2005年— Francisco Mojica,西班牙阿利坎特大学

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Francisco Mojica是1993年报道的第一个表征现在称为CRISPR基因座的研究人员。他在1990年代一直在研究它们,并且在2000年,他意识到报道为完全不同的重复序列实际上具有一组共同的特征。现在被称为CRISPR序列的标志(他通过与Ruud Jansen的通信来创造了CRISPR这个术语,后者于2002年首次使用了该术语)。他在2005年报告说,这些序列与噬菌体基因组的片段匹配(Mojica等,2005)。这一发现使他正确地假设CRISPR是一种适应性免疫系统。另一个独立工作的小组在同一时间发表了类似的发现(Pourcel等,2005)。


Cas9和PAM的发现

2005年5月,法国国家农业科学研究所(INRA)的亚历山大·布洛汀(Alexander Bolotin)

Bolotin正在研究刚刚被测序的嗜热链球菌细菌,揭示了一个不寻常的CRISPR基因座(Bolotin等,2005)。尽管CRISPR阵列与先前报道的系统相似,但它缺少一些已知的cas基因,而是包含新的cas基因,包括一个编码一种他们预测具有核酸酶活性的大蛋白质的基因,现在称为Cas9。此外,他们指出,与病毒基因具有同源性的间隔子在一端均具有相同的序列。此序列,即原间隔子相邻基序(PAM),是目标识别所必需的。

适应性免疫的假想方案
2006年3月-尤金·库宁(Eugene Koonin),美国国家生物技术信息中心

Koonin正在通过计算分析研究直系同源蛋白质的簇,并提出了一种CRISPR级联作为细菌免疫系统的假想方案,该方案基于与天然间隔基阵列中噬菌体DNA同源的插入片段,从而摒弃了之前的Cas蛋白可能包含新的DNA修复的假设。

自适应免疫的实验证明
2007年3月-Philippe Horvath,Danisco法国SAS

嗜热链球菌在乳制品工业中广泛用于制造酸奶和奶酪,Danisco的科学家希望探索其对噬菌体攻击的反应,噬菌体攻击是工业酸奶制造中的常见问题。Horvath及其同事通过实验证明CRISPR系统确实是一种适应性免疫系统:它们将新的噬菌体DNA整合到CRISPR阵列中,从而使它们能够抵御下一波攻击噬菌体(Barrangou等人,2007年)。此外,他们表明,Cas9可能是干扰所需的唯一蛋白质,CRISPR系统通过该过程使入侵的噬菌体失活,目前尚不清楚。

间隔子序列被转录成指导RNA 
2008年8月—荷兰瓦赫宁根大学的John vander Oost

科学家们很快开始填写有关CRISPR-Cas系统如何“干扰”入侵噬菌体的一些细节。第一条关键信息来自John van der Oost及其同事,他们发现在大肠杆菌中,源自噬菌体的间隔子序列被转录为小RNA,称为CRISPR RNA(crRNA),可将Cas蛋白引导至靶DNA(Brouns等,2008)。


CRISPR作用于DNA靶标
2008年12月—美国伊利诺伊州西北大学的LucianoMarraffini和Erik Sontheimer

理解干扰机理的下一个关键文章来自Marraffini和Sontheimer,他们优雅地证明了目标分子是DNA,而不是RNA(Marraffiniand Sontheimer,2008)。这有些令人惊讶,因为许多人认为CRISPR与靶向RNA的真核RNAi沉默机制相似。Marraffini和Sontheimer在他们的论文中明确指出,如果可以将其转移到非细菌系统中,则该系统可能是功能强大的工具。(然而,应该指出的是,不同类型的CRISPR系统可以靶向RNA(Hale等,2009))。


Cas9切割目标DNA 
2010年12月— Sylvain Moineau,加拿大魁北克市拉瓦尔大学

Moineau及其同事证明了CRISPR-Cas9在目标DNA的精确位置,PAM上游3个核苷酸处产生了双链断裂(Garneauet al。,2010)。他们还证实,Cas9是CRISPR-Cas9系统中裂解所需的唯一蛋白质。这是II型CRISPR系统的显着特征,其中干扰是由单个大蛋白(此处为Cas9)与crRNA介导的。

发现Cas9系统的tracrRNA 
2011年3月— Emmanuelle Charpentier,瑞典于默奥大学和奥地利维也纳大学

关于自然CRISPR-Cas9引导的干扰机制的最后一个难题来自EmmanuelleCharpentier。他们对化脓链球菌进行了小RNA测序,该链球菌具有含Cas9的CRISPR-Cas系统。他们发现除了crRNA外,还存在第二个小RNA,他们称为反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)(Deltcheva et al。2011)。他们表明tracrRNA与crRNA形成双链体,正是这种双链体将Cas9引导至其靶标。


CRISPR系统可以在其他物种中异源发挥作用
2011年7月— Virginijus Siksnys,立陶宛维尔纽斯大学

Siksnys和同事从嗜热链球菌(II型系统)克隆了整个CRISPR-Cas基因座,并在大肠杆菌(不含II型系统)中表达,他们证明了它能够提供质粒抗性( Sapranauskas等,2011)。这表明CRISPR系统是独立的单元,并证实II型系统的所有必需组件都是已知的。


Cas9介导的裂解的生化表征
2012年9月—立陶宛维尔纽斯大学VirginijusSiksnys

2012年6月-Charpentier和Jennifer Doudna,加州大学伯克利分校

利用其异源系统,Siksnys和他的团队从大肠杆菌菌株的crRNA中纯化了Cas9,该菌株经工程改造后可携带嗜热链球菌CRISPR基因座,并进行了一系列生化实验,以机械方式表征Cas9的作用方式(Gasiunas等人) (2012)。他们验证了切割位点和对PAM的需求,并使用点突变显示RuvC结构域切割了非互补链,而HNH结构域切割了互补位点。他们还指出,crRNA可以修剪到足以进行有效切割的20 nt延伸片段。最令人印象深刻的是,他们表明他们可以通过改变crRNA的序列来对Cas9进行重新编程,使其靶向选择的位点。

与Gasiunas等类似的发现。几乎同时,Emmanuelle Charpentier与加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna合作进行了报道(Jinek等,2012)。Charpentier和Doudna还报告说,可以将crRNA和tracrRNA融合在一起以创建一个单一的合成指南,从而进一步简化了系统。(尽管发表于2012年6月,但该论文是在Gasiunas等人之后提交的。)


CRISPR-Cas9用于基因组编辑
2013年1月—张峰,麻省理工学院广泛研究所和哈佛大学,麻省理工学院麦戈文脑科学研究所

此前曾在TALENs等其他基因组编辑系统上工作的Zhang首次成功地使CRISPR-Cas9适应真核细胞中的基因组编辑(Cong等,2013)。Zhang和他的团队设计了两个不同的Cas9直系同源基因(来自嗜热链球菌和化脓性链球菌),并证明了在人和小鼠细胞中的靶向基因组切割。他们还表明,该系统(i)可以编程为靶向多个基因组位点,并且(ii)可以驱动同源性指导的修复。哈佛大学乔治教堂实验室的研究人员在同一期《科学》上也报告了类似的发现(Mali等,2013)。

参考资料:

https://www.broadinstitute.org/what-broad/areas-focus/project-spotlight/crispr-timeline

https://www.broadinstitute.org/what-broad/areas-focus/project-spotlight/questions-and-answers-about-crispr?jwsource=cl

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