中科院杨辉发表6篇CNS,在基因编辑等领域取得重大进展,所创公司获亿元融资

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基因修饰动物是研究在发育和疾病中基因功能的重要工具。CRISPR/Cas9系统有效的应用于构建基因敲除和敲入小鼠。而杨辉团队正好专注于该领域。

杨辉,30岁时,就成为中科院上海生科院神经所研究员;2015年,入选国家“青年千人计划”;2019年,杨辉博士获得国家杰出青年基金资助。由杨辉创办的辉大(上海)生物科技有限公司(简称辉大基因)宣布完成逾亿元人民币的A轮融资,由辰德资本领投,新投资方药明康德、惠每资本、雅惠资本以及原有投资方夏尔巴投资四家机构跟投。本轮融资所得将主要用于辉大基因的核心临床管线的推进,组建研发与临床前研究团队以及开展GMP级生产车间的建设。此前,辉大基因曾在2018年11月完成了夏尔巴投资的3000万元人民币的天使轮融资。

目前杨辉博士已在ScienceNature 、Cell 等顶级期刊上发表近27篇学术论文,iNature在这里系统介绍杨辉的3篇Cell,2篇Nature及1篇Science成果:

【1】2019年6月10日,中科院神经科学研究所杨辉、周海波,与四川大学郭帆和中科院上海营养所李亦学共同通讯在Nature在线发表题为“Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis”的研究论文,该研究进一步验证了BE3与ABE两种DNA单碱基编辑器在RNA水平上的脱靶现象,提出了针对这两种系统的优化方案,有效降低了它们在RNA水平上的脱靶效应;

【2】2019年2月28日,中国科学院灵长类神经生物学重点实验室杨辉研究组,上海生科院李亦学及斯坦福大学Lars M. Steinmetz等人在Science发表题为“Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos”的研究论文,该研究建立了一种被命名为GOTI(Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection)的新型脱靶检测技术,并使用该技术发现: 近年来兴起的单碱基编辑技术有可能导致大量无法预测的脱靶,因而存在严重的安全风险。此研究显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性,并且可以在不借助于任何脱靶位点预测技术的情况下发现之前的脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点,为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新工具,有望成为新的行业检测标准;

【3】II型细菌CRISPR / Cas系统是一种新型基因组靶向技术,易于多重基因敲除。2013年9月12日,美国Whitehead生物医学研究所Rudolf Jaenisch团队(杨辉第一作者)在Cell 在线发表题为“One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering”的研究论文,该研究通过共注射具有Cas9 mRNA和不同sgRNA的受精卵以及不同大小的DNA载体来创建报告基因和条件突变小鼠。使用这种一步法,研究人员在Nanog,Sox2和Oct4以及Mecp2基因条件突变小鼠。此外,使用靶向Mecp2基因中两个独立位点的sgRNA,产生了具有约700bp的缺失的小鼠。最后,该研究分析了基因修饰小鼠和ESC系中5种sgRNA的潜在脱靶,并在极少数情况下鉴定了脱靶突变;

【4】携带多个基因突变的小鼠传统上通过胚胎干细胞中的连续重组和/或具有单个突变的小鼠的耗时杂交产生。CRISPR / Cas系统被认为是有效的基因靶向技术,具有多重基因组编辑的潜力。2013年5月9日,美国Whitehead生物医学研究所Rudolf Jaenisch团队(杨辉共同第一作者)在Cell 在线发表题为“One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering”的研究论文,该研究证明CRISPR / Cas介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干细胞(ES)中的五个基因(Tet1,2,3,Sry,Uty-8等位基因)。将靶向Tet1和Tet2的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中,产生具有双等位基因突变的小鼠,效率为80%;最后,该研究显示Cas9 mRNA / sgRNA与突变体寡核苷酸的共注射在两个靶基因中同时产生精确的点突变。因此,CRISPR / Cas系统允许一步产生携带多个基因突变的动物,这种方法将大大加速功能冗余基因的体内研究

【5】2012年4月,徐国良等人(杨辉第一作者)在Cell 在线发表了题为“Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells”的研究论文,该研究首次建立了来自小鼠精子的孤雄单倍体胚胎干细胞,并证明这些细胞能够代替精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠(称为“半克隆”技术)

【6】2011年9月,徐国良等人(杨辉共同第一作者)在Nature 在线发表了题为“The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes”的研究论文,该研究发现在小鼠受精卵中,5-甲基胞嘧啶(5mC)的氧化发生在父本基因组上,将5mC变为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。此外,该研究还证明双加氧酶Tet3特别富集在雄性原核中。因此,Tet3介导的DNA羟化作用参与自然受精后合子父本DNA的表观遗传重编程,并且还可能有助于动物克隆过程中的体细胞核重编程

1、单碱基编辑技术脱靶现象的验证及优化

最近开发的DNA碱基编辑方法能够在基因组DNA中直接产生所需的点突变而不产生任何双链断裂(DSB),但是脱靶编辑的问题限制了这些方法的应用。虽然先前的几项研究已经评估了基因组DNA中的脱靶突变,但现在认识到常用的DNA碱基编辑器中的脱氨酶通常表现出RNA结合活性。例如,发现胞嘧啶碱基编辑器(CBE)中使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1靶向DNA和RNA,并且发现腺嘌呤碱基编辑器(ABE)中使用的腺嘌呤脱氨酶TadA诱导RNA上的位点特异性肌苷形成。 

然而,尚未评估由DNA碱基编辑引起的任何潜在的RNA突变。腺相关病毒是DNA编辑基因疗法最常用的传递系统;这些病毒可以在体内维持长期基因表达,因此DNA基因编辑诱导的潜在RNA突变的程度非常值得关注。

在这里,研究人员定量评估了由CBEs和ABEs诱导的RNA单核苷酸变异(SNV)。研究人员发现胞嘧啶碱基编辑器BE3和腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10都产生了数万个脱靶RNA SNV。随后,通过工程化脱氨酶,研究人员发现三种CBE变体和一种ABE变体将脱靶RNA SNV降低至基线,同时保持其有效的DNA靶向活性。该研究揭示了DNA编辑中脱靶效应的先前被忽视的方面,并且还证明通过工程脱氨酶可以消除这种效应。值得注意的是,目前的优化方案都不能解决BE3单碱基编辑系统对基因组DNA 上产生的sgRNA序列非依赖性脱靶问题,需要进一步探索新的优化方案解决这一问题。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1314-0

2、杨辉/李亦学/Lars M. Steinmetz等团队建立新型脱靶检测技术,基因编辑工具安全性评估或迎来新突破

CRISPR/Cas9是广泛关注的新一代基因编辑工具,自从2012年被发明以来,它一直以其高效性和特异性备受世人的期待,然而值得注意的是,CRISPR/Cas9从问世以来,其脱靶风险一直备受关注,如果将CRISPR/Cas9及其衍生工具用于临床的话,脱靶效应可能会引起包括癌症在内的很多种副作用。

在此之前,人们推出过多种检测脱靶的方案。以前的方法或者依赖于计算机软件预测,或者依赖于高通量测序检测DSB产生,还有体外检测的方法。这些方法都存在一些局限性,不能高灵敏性检测到脱靶突变,尤其是单核苷酸突变。因此一种能够突破之前限制的脱靶检测技术,将会成为CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最终走上临床的关键。人们迫切希望可以找到一种既能够不依赖于脱靶位点预测,又能有足够信噪比的精密脱靶检测手段。

如果要提升检测脱靶效应的精度,就必须彻底颠覆原有的脱靶检测手段。首先,为了实现不借助于脱靶位点预测,这就要求必须找到非常严格的对照组来确定基因突变的位点;同时为了检测不依赖于sgRNA的随机突变,最好使用基于单细胞全基因组测序。

为了实现以上目标,杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术。研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候,编辑一个卵裂球,并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时,将整个小鼠胚胎消化成为单细胞,利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白,分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞,再进行全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵,理论上基因背景完全一致,因此直接比对两组细胞的基因组,其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。

在杨辉实验室全体成员与合作单位的共同努力下,GOTI系统被成功建立了起来。团队成员先用该系统检测了最经典的CRISPR/Cas9系统,发现设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应,这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。

团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3,这个系统可以精确引入点突变,在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。然而在GOTI的检测下发现,BE3存在非常严重的脱靶,而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点,因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。

团队分析后认为,这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上,因此经典版本的BE3有着很大的隐患,目前不适合作为临床技术。研究团队的这些重要发现,证实了以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险,也世人重新审视了这些新兴技术的风险。

更重要的是,此工作建立了一种在精度、广度和准确性上远超越之前的基因编辑脱靶检测技术,有望由此开发精度更高、安全性更大的新一代基因编辑工具,建立行业的新标准。

参考信息:

http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aav9973

3、通过CRISPR / Cas技术生成携带报告基因和条件等位基因的小鼠

具有特定基因修饰的小鼠是研究发育和疾病的有价值的工具。胚胎干细胞(ES)中的传统基因靶向虽然适合于在内源基因中产生复杂的遗传修饰,但是复杂且耗时。使用直接注射位点特异性核酸酶的DNA或mRNA进入单细胞期胚胎的新方法大大加速了转基因小鼠和大鼠的生产,产生了特定序列的DNA双链断裂(DSB),导致靶向突变。共表达与DSB侧翼序列同源的单链或双链DNA模板可产生具有精确点突变或DNA插入的突变等位基因。最近,将两对ZFN和两个双链供体载体原核注射到大鼠受精卵中,产生含有loxP侧翼(floxed)等位基因的大鼠。然而,ZFN和双链供体载体的复杂且耗时的设计和产生限制了该方法的应用。

CRISPR和Cas蛋白在细菌和古细菌中起基于RNA的适应性免疫系统的作用。II型细菌CRISPR / Cas系统已被证明是有效的基因靶向技术,其促进多重基因靶向。因为Cas9的结合受工程化sgRNA和靶基因组DNA序列之间的简单碱基对互补性的指导,所以可以通过提供工程化的sgRNA将Cas9导向任何基因组基因座。

文章总结

以前,研究人员使用II型细菌CRISPR / Cas系统作为有效工具,一步产生携带多个基因突变的小鼠)。然而,这项研究留下了许多未解决的问题。例如,阐明了使用CRISPR / Cas基因编辑方法将DNA构建体插入内源基因的效率以及其创建条件性突变小鼠的效用。在这里,研究人员一步生成携带三种不同基因的报告基因构建的小鼠以及条件突变小鼠的衍生。此外,研究人员进行了广泛的脱靶切割分析,并显示靶向小鼠和源自CRISPR / Cas受精卵注射的ES细胞中的脱靶突变是罕见的。

参考信息:

http://sci-hub.tw/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23992847

4、通过CRISPR / Cas介导的基因组工程一步产生携带多基因突变的小鼠

转基因小鼠是了解发育和疾病中基因功能的重要工具。突变小鼠通常通过插入诱变或通过基因靶向方法产生。在常规基因靶向方法中,通过小鼠胚胎干(ES)细胞中的同源重组引入突变。注射到野生型(WT)胚泡中的靶向ES细胞可以促成嵌合动物的种系,产生含有靶向基因修饰的小鼠。生产单基因敲除小鼠是昂贵且耗时的,并且制造双突变小鼠更是如此。此外,在大多数其他哺乳动物中,没有可用于嵌合动物的已建立的ES细胞系,这极大地限制了许多物种的遗传研究。

已经开发了替代方法,通过将位点特异性核酸酶的DNA或mRNA直接注射到单细胞胚胎中以在各种物种的特定基因座处产生DNA双链断裂(DSB)来加速基因组修饰的过程。然后可以通过易错的非同源末端连接(NHEJ)修复由这些位点特异性核酸酶诱导的DSB,导致突变小鼠和在切割位点携带缺失或插入。为了剖析具有冗余功能的基因家族成员的功能或分析遗传途径中的上位关系,需要具有两个或更多个突变基因的小鼠,促使开发用于产生携带多个突变基因的动物的有效技术。

最近,II型细菌CRISPR / Cas系统已被证明是一种有效的基因靶向技术,具有多重基因组编辑的潜力。细菌和古细菌已经进化出基于RNA的适应性免疫系统,其使用CRISPR和Cas蛋白来检测和破坏入侵病毒和质粒。Cas蛋白,CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)形成核糖核蛋白复合物,其靶向并降解外来核酸。

ES细胞和小鼠中的多重基因组编辑

在这里,研究人员使用CRISPR / Cas系统驱动基于NHEJ的基因破坏和基于同源定向修复(HDR)的精确基因编辑,以实现干细胞和小鼠中多个基因的高效和同时靶向。

参考信息:

http://sci-hub.tw/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643243

5、卵母细胞注射雄激素单倍体胚胎干细胞产生转基因小鼠

单倍体细胞适合进行遗传分析。最近通过孤雌生殖衍生小鼠单倍体胚胎干细胞(haESCs)的成功使得能够在哺乳动物细胞中进行遗传筛选。然而,尚未实现从这些haESC成功生成活体动物,这是将遗传分析扩展到生物体水平所需的。

在这里,研究人员报告从雄激素胚泡衍生haESCs。这些称为AG-haESC的细胞部分维持父系印记,表达经典的ESC多能性标记,并在注入二倍体胚泡后对各种组织(包括种系)有贡献。

引人注目的是,将AG-haESCs注射到MII卵母细胞中可以获得活小鼠,并且这些小鼠具有携带haESC的遗传性状并发育成为可育的成年小鼠。此外,通过同源重组的基因靶向在AG-haESC中是可行的。结果表明,AG-haESC可以用作遗传易处理的受精剂,通过注射到卵母细胞中来产生活动物。

参考信息:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867412004217?via%3Dihub

6、Tet3 DNA双加氧酶在卵母细胞表观遗传重编程中的作用

精子和卵子携带独特的表观遗传修饰,通过受精后的重编程进行调整。受精卵中的父系基因组在第一次有丝分裂之前经历活性DNA去甲基化。这种父系表观基因组重塑的生物学意义和机制尚不清楚。

在这里,研究人员发现在小鼠受精卵中,5-甲基胞嘧啶(5mC)的氧化发生在父本基因组上,将5mC变为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。此外,该研究还证明双加氧酶Tet3特别富集在雄性原核中。在来自条件性敲除小鼠的Tet3缺陷受精卵中,5mC至5hmC的父本 – 基因组转换未能发生,并且5mC的水平保持恒定。Tet3的缺乏也阻碍了父本Oct4和Nanog基因的去甲基化过程,并延迟了早期胚胎中父系衍生的Oct4转基因的后续激活。

在种系中耗尽Tet3的雌性小鼠表现出严重降低的繁殖力,并且缺乏母体Tet3的杂合突变体后代遭受发育失败的发生率增加。缺乏Tet3的卵母细胞似乎也具有降低从体细胞重编程注射的细胞核的能力。因此,Tet3介导的DNA羟化作用参与自然受精后合子父本DNA的表观遗传重编程,并且还可能有助于动物克隆过程中的体细胞核重编程。

参考信息:

https://www.nature.com/articles/nature10443图像

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