siRNA的细胞转染及筛选

siRNA的细胞转染及筛选

Cell transfection and screening

实验原理

继植物中发现基因沉默现象后,动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明,并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定,足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA(Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA,由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内,在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。

技术应用

基因功能的体内外研究

RNAi类药物研发

实验流程

siRNA的细胞转染及筛选
实物数据信息实验周期
客户提供靶细胞目的基因NCBI登陆号、靶细胞培养条件4周
我们提供剩余siRNA基本实验步骤、细胞照片、 qPCR原始数据,扩增曲线,熔解曲线

实验结果展示

siRNA的细胞转染及筛选

   图1 相对定量 PCR 检测 3 组 siRNA 转染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果

TROUBLESHOOTING

实验问题原因推荐解决方法
荧光标记的阴性对照siRNA无可见荧光?转染效率不高保证细胞状态良好;选择合适的转染试剂,调整转染试剂siRNA的比例;避免培养基中含有抗生素;适当延长观察时间。
siRNA转染实验阳性对照和靶基因均无干扰效果?转染体系提高转染效率,模式siRNA的使用浓度,注意实验操作防止RNA每污染。
阳性对照有效而靶基因的siRNA转染无干扰效果?干扰靶点无效设计多对siRNA片段进行尝试,选择干扰效率最高的靶点。
同一对siRNA在不同细胞中干扰效果不同?不同细胞特性不同转染效率相近,不同细胞核酸酶的活性高低也会影响siRNA的代谢速度,导致沉默效果出现差异。
本底表达丰度不同本底表达丰度很高或很低对干扰效果都有影响。
转染效率不同优化转染方式,提高转染效率。

常见问题FAQ

Q:化学合成siRNA的结构?

A:化学合成的siRNA为正义链和反义链双链结构,正义链与靶序列相同,通常为19个核苷酸。另外正义链和反义链的3‘端均含有dTd的悬垂,脱氧核糖核苷可保护siRNA免受降解。客户未有验证靶点的情况下建议一次合成3对以上的siRNA进行筛选工作。

Q :化学合成的siRNA有哪些可选种类?特点有哪些?

种类特点
化学合成siRNA无修饰和荧光标记,合成方便快捷,价格便宜。
化学修饰siRNA对正义链进行化学修饰更加稳定,延长了作用时间。
荧光标记siRNA对正义链进行荧光标记(如CYC3)后可通过观察荧光优化转染条件,也便于对siRNA进行定位追踪。

Q:细胞转染实验的siRNA推荐浓度是多少?

A:细胞转染实验的终浓度建议采用50-100NM,浓度过高导致细胞毒性。对于21bp的siRNAoligo,有如下简单关系:20D=6.0nmol=80ug。一般购买20D包装的siRNA,可采用DEPC水配成母液后使用前稀释。

Q:实验中采用阴性对照和阳性对照siRNA的目的?

A:由于高浓度的siRNA有可能导致非常异性的干扰结果,因此必须设置阴性对照,建议使用通过的带有荧光标记的阴性对照siRNA;将靶序列打乱之后的阴性对照siRNA,未经验证,有可能引起off-target现象。阳性对照可以确保实验中的操作无误,如转染操作,RNA抽提方法以及qPCR检测结果都是可信的。

Q:化学合成的siRNA靶点序列将来可否用于构建shRNA质粒载体和病毒包装?

A:已确认干扰效果的siRNA靶点可以进行shRNA质粒载体的构建个病毒包装工作,但毕竟表达体系不同可能存在一定的风险,干扰效果会有一定的差异。建议构建好shRNA质粒载体后进行干扰效果的验证工作。

参考文献

1.Paul CP, Good PD Winer l Effectie expression of small interfering R NA in human cells. Nature Biotechnology2002,20(5):505-508.

2.Ladunga I. More complete gene silencing by fewer siR NAs: transparent optimized design and biophysical signatuse. Nucleic Res 2007,35(2):433-440.

上一篇:

下一篇:

相关新闻

在线咨询
联系我们

联系我们

QQ: 2487148818
座机:010-53516075
手机:13811498884

公众号
公众号
返回顶部