最高CRISPR插入效率诞生!修饰DNA5’末端可提高五倍效率!

编译:催化剂


近日,伊利诺伊州尚帕尼市-伊利诺伊大学的研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑系统将基因插入人细胞,插入效率创史上新高。成功率高是利用CRISPR进行临床基因治疗应用的必要步骤。相关论文以题为:An efficient gene knock-in strategy using 5′-modified double-stranded DNA donors with short homology arms 发表在《Nature Chemical Biology》杂志上。

目前,在人类肾脏293T细胞系中不同的遗传位点的测试中都得到了改善,其中一个位点的插入率达到了65%,而之前最高水平才到15%。

最高CRISPR插入效率诞生!修饰DNA5’末端可提高五倍效率!

CRISPR是关闭或“敲除”基因的有效工具。但是,在人类细胞中,插入或“敲入”基因的效率并不算高。

一种好的基因敲入方法对于基因治疗应用和研究基因功能的基础生物学研究都很重要。利用基因敲入,科学家可以在任何基因上添加标签,研究其功能,并查看基因表达怎样受到癌症或染色体结构变化的影响,或者在基因治疗应用中,如果某人患有由缺失基因引起的疾病,我们希望能够插入它。

为了寻找提高效率的方法,Zhao的课题小组研究了13种方法来修饰插入的DNA。他们发现,DNA末端的微小变化能够同时增加插入的速度和效率。

研究人员尝试使用CRISPR-Cas9精确靶向插入的特定位点,将不同大小的5’末端修饰的DNA片段(0.7kb-2.5kb)连同50个碱基的同源臂,插入人类胚胎肾293T细胞的基因组中的多个位点,获得前所未有的65%-40%的插入效率。即使插入较大的DNA片段——这是最难插入的片段,效率也提高了2至5倍。他们证实,这种5’端修饰使得在人癌细胞和干细胞的不同位点的插入效率提高可达5倍。

最高CRISPR插入效率诞生!修饰DNA5’末端可提高五倍效率!

CRISPR是继RNA干扰技术、高通量测序技术等之后生物科学发展历史上最具颠覆性技术之一,使用高效、迅速且简单,在生物医学研究领域引起一场巨变,并因此成为生物医学实验室常规技术。

随着CRISPR基因治疗临床实验的初步成功,以及2018年的基因编辑婴儿事件预热,CRISPR技术被越来越多的研究人员用来改造人类基因以消除疾病,创造生命力更加顽强的植物,消灭病原体等。

在过去的7年中CRISPR技术斩获了生命科学领域各种重量级奖项,包括生命科学突破奖,盖尔德纳国际奖等,《Science》年度突破、《Nature》年度人物均授予了CRISPR单碱基基因编辑技术的突破,2019年9月,北京大学邓宏魁组完成世界首例基因编辑治疗艾滋病和白血病,使CRISPR技术再一次成为生命科学的焦点。

随着近几年的发展,研究者开发出越来越多基于CRISPR的新型基因编辑技术,例如CRISPR转录激活/抑制技术,基因定位,表观遗传修饰,单碱基基因编辑系统(BE2,BE3,ABE等),CRISPR基因突变检测系统(Sherlock、DETECTR),无修复模板基因敲入技术等。

CRISPR/Cas9系统的应用更加便捷、高效,也更广泛,目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌等基因组精确修饰,成为科研人员的强大工具,基于CRISPR临床实验已经取得初步成功。

参考文献:

An efficient gene knock-in strategy using 5′-modified double-stranded DNA donors with short homology arms

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