酶联免疫吸附测定
ELISA
实验原理
酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。基本原理是：1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高，故可放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据反应后颜色的深浅进行定性或定量分析（见图4.7）。
图4.7 ELISA检测原理示意图
实验流程
| 实物 | 数据信息 | 实验周期 | |
| 客户提供 | 样本、ELISA试剂盒 | ELISA试剂盒说明书 | 2周及以上 |
| 我们提供 | 剩余试剂盒 | 基本实验步骤、EXCEL原始数据、标准曲线 |
实验结果展示
Conecntrations
图4.8ELISA标准曲线
表4.1五组样本目的蛋白ELISA吸光度值及浓度
| OD1 | OD2 | OD3 | 平均值 | C(pg/ml) | |
| 1 | 0.761 | 0.763 | 0.762 | 0.762 | 136.80 |
| 2 | 0.631 | 0.633 | 0.635 | 0.663 | 130.71 |
| 3 | 0.704 | 0.702 | 0.701 | 0.702 | 144.11 |
| 4 | 0.903 | 0.904 | 0.901 | 0.903 | 144.17 |
| 5 | 0.623 | 0.618 | 0.621 | 0.621 | 117.45 |
TROUBLESHOOTING
| 实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
| 实验重复性不佳？ | 操作重复性不佳 | 同一人员重复操作，注意将样本充分混匀，保证加样量一致，其他操作过程如孵育时间，洗板条件保持一致。 |
| 加样孔显色过深？ | 洗涤不充分 | 充分洗涤，彻底拍干。 |
| 加样时间过长 | 合理安排工作量，样本量多要控制好加样速度或分批操作。 | |
| 孵育温度过高 | 采用合适的温度。 | |
| 孵育时间过长 | 注意减少孵育时间。 | |
| 加样孔显色过浅？ | 试剂盒未充分平衡 | 从 4℃冰箱取出试剂盒后于室温平衡至少20分钟 |
| 洗板时冲击力太大 | 注意调整洗涤时间和洗涤次数。 | |
| 底物作用时间不足 | 注意准确定时。 | |
| 样本浓度稀释过大 | 预实验摸索样本稀释浓度。 | |
| 加样孔包括标准品加样孔都未显色？ | 显色液过期 | 更换新的ELISA试剂盒 |
| 使用错误的试剂 | 漏加酶结合物或者错误的使用终止液提前终止了反应。 |
常见问题FAQ
Q：ELISA 试 剂 盒 主 要 有 哪 些 试 剂 ？
A：ELISA 试剂盒中主要有
1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
3）酶的底物；
4）标准品；
5）结合物及标本的稀释液；
6）洗涤液；
7）酶反应终止液。
Q：造成ELISA实验结果不正常的因素有哪些？
A：造成ELISA测定结果不正常的因素主要有：
1）标本因素：样本需新鲜采集，防止污染，且准确稀释至适当的倍数。
2）试剂因素：ELISA试剂盒在保质期内，其他试剂如蒸馏水的水质等。
3）操作因素：注意操作细节，如加样不可太快，避免加在孔壁上；洗板过程中注意洗液不能溢出孔外；显色要注意控制时间等。
Q：如何准备需要进行ELISA检测的细胞样本？
A：检测细胞分泌性成份时：用无菌管收集细胞培养上清，离心20分钟（2000-3000转/ 分）
取上清检测。检测细胞内成份时：收集细胞，用PBS（pH7.2-7.4）稀释细胞浓度至 106/ml左右，通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟（2000-3000 转 / 分），收集上清。保存过程中如有沉淀形成，需再次离心。
Q：ELISA 试剂盒（96 孔规格）一般可以进行多少个样本的检测？
A：标准品孔和待测样本孔需进行复孔操作以保证数据的可信度。每次需将标准品按照7-8个梯度稀释以制备准确的标准曲线。一次96孔板实验可以进行20-25个样本的检测工作。
Q：ELISA 的检测数据如何进行处理？
A：1）将得到的各个复孔浓度的吸光度值计算平均值。
2）按照横坐标为梯度稀释的标准品浓度，纵坐标为吸光度值做散点图，添加趋势线，利用多项式回归分析计算由以上数据产生的公式与 R2 值（R2 值越接近1说明线性关系越好）。
3）根据公式及待测样本的平均吸光度值计算样本中目的蛋白的浓度。
Q：常用的免疫学检测方法ELISA和WB的区分有哪些？
| 区分项目 | ELISA | WB |
| 目的 | 不仅可以检测抗原还可以检测抗体，对其进行定性和定量分析。 | 定性分析，对胶片灰度值进行半定量分析。 |
| 抗体识别位点 | 线性化或构象型位点均可。 | 线性化位点。 |
| 优点 | 96 孔板可以处理多个样本，通过设置复孔，对照，梯度可提高数据的可信度，且灵敏度高于WB。 | 可明确蛋白的分子量大小，以及是否为多聚体或发生降解。 |
| 缺点 | 如果抗体有非特异性结合，得到的数值则不可信。 | 一次电泳最多处理10-20 个样本。 |
参考文献
1. J.R. Crowther. The ELISA Guidebook. Hunana Preaa,2001.
