质粒载体构建

质粒载体构建

vector construction

实验原理

质粒载体可以有效地运载外源基因片段进入受体细胞,可以独立自主大量复制并且很容易从宿主细胞中分离纯化,因而在分子生物学使用十分广泛。常用的载体可分为克隆载体和表达载体,根据载体进入受体细胞的不同,分为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体以及穿梭载体。

技术应用

目的基因的表达研究

基因、蛋白的功能研究

实验流程

质粒载体构建
实物数据信息实验周期
客户提供非常用的质粒载体目的基因NCBI登录号、载体图谱3周
我们提供质粒/菌株基本实验步骤、电泳图片、测序报告

实验结果展示

A                                                            B

质粒载体构建

A:目的片段的菌落PCR鉴定结果(泳道1-5:1-5号克隆的菌落PCR鉴定结果,其中1-3号样本为菌落PCR阳性样本,4-5号样本为菌落PCR阴性样本;泳道6:阳性对照;泳道7:阴性对照)。

B:目的片段的酶切电泳结果(目的片段的酶切电泳结果,载体片段5300bp,目的片段820bp)。

TROUBLESHOOTlNG

实验问题原因推荐解决方法
连接转化后平板上全部为阴性克隆?连接效率优化目的片段与载体片段的比例,载体片段的摩尔数过高导致阴性克隆增多。
连接转化后平板上无克隆?感受态度细胞效率不高重新制备新鲜的感受态细胞或购买商品化的感受细胞。
连接体系增加目的片段与载体片段的摩尔数。
收到的质粒转染效率很低?质粒纯度提供的10ug小抽质粒适用于分子生物学实验,其纯度及浓度都不适合用于细胞转染,需客户进行高纯度的质粒抽提工作。
细胞难转染在保证细胞状态良好的条件下,摸索合适的转染试剂以及转染条件。
过表达质粒成功转染后WB未见明显表达?蛋白功能过量表达的蛋白对宿主细胞可能有毒性作用。

常见问题 FAQ

Q:如何看懂一个载体的质粒图谱?

A:1)首先明确载体的功能是克隆载体还是表达载体,表达载体含有启动子、终止等序列,原核表达载体常用T7启动子、真核表达载体载体常用CMV启动子。2)明确多克隆位点(MCS)有哪些酶切位点可用,插在该区域的外源基因可以像载体中的正常序列一样进行复制和扩增。3)方便的筛选标记,原核抗性如氨、卡那,真核抗性如新霉素、嘌呤霉素。4)有哪些荧光标记或蛋白标签序列。5)注意是否有其他功能元件。

Q :方便追踪目标基因表达的GFP的常见真核表达载体有哪几种,各有说明区别?

A:可以提供pEGFP-C1和pIES2-EGFP三种载体选择(EGFP中E代表Enhanced即经过改造的GFP,荧光强度得到加强,表达效率更高)。前两种为EGFP的融合表达载体,分别在目的基因的N端和C端进行融合表达,后一种为目的基因与EGFP共表达的载体。

Q :酶切连接有哪些种类?

酶切连接分类要求连接结果
粘性末端连接双酶切连接对酶切片段切胶回收外原片段可定向插入,阳性克隆率高
单酶切连接载体线性化后需磷酸酶脱磷出来外源片段会以正反两个方向插入载体,可能出现串联拷贝
平末端连接采用高浓度的连接酶,注意载体和目标片段的比例,可加入PEG4000等凝聚剂可能出现串联拷贝,连接效率低,注意增加连接酶量和连接时间

Q:plRES2-EGFP载体中的IRES序列的作用是什么?

A:IRES序列的全称是内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Site),一般真核mRNA的翻译都需要5‘帽子来介导核糖体结合。微小RNA病毒家族则外例外,这类病毒在其mRNA前没有帽子位点,但却有600-1200bp的5‘非翻译区,其中含有多个非起始AUG,这段长的非翻译区即叫做IRES序列。IRES能招募核糖体对mRNA进行翻译。在同一启动子下,将目的基因(注意要加终止子)后加IRES及EGFP序列,IRES后的EGFP就能独立地起始翻译,可与目的基因共表达的作用,但表达量要低于目的基因,GFP荧光剂有可能会较弱。

Q:重组克隆的筛选鉴定方法有哪些?

鉴定名称具体方案
抗性筛选采用含氨苄、卡那抗性的平板或培养基培养
菌落PCR以少量菌液作为模板采用特定引物扩增检测是否能够扩增到目标片段
酶切鉴定电池判断酶切获得目的的片段大小
测序鉴定确定序列中每一个碱基与预期一致

参考文献

1. J e a n Pe c c o u d. G e n e  S y n t h e s i s: M e t h o d s and Protocols. Humana Press,2012.

2. Benjamin Lewin. Genes IX [M]. Pearson Education,2007.

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