荧光实时定量PCR

荧光实时定量PCR

QPCR

实验原理

实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种:荧光染料和荧光探针。

荧光染料SYBR Green:嵌入到双链DNA分子后构象发生变化,能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光;而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步,见图 4.1。

荧光实时定量PCR

图 4.1 SYBR Green 荧光染料法qPCR检测原理图

TaqMan 荧光探针:扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq 酶的 5′-3′ 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,见图 4.2。

荧光实时定量PCR

图 4.2 TaqMan 荧光探针法qPCR 检测原理图

SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别

方法优点缺点应用
SYBR GREEN 法方便快捷,不必针对各个基因设计合成TaqMan探针,具有价格优势。无模板特异性,对引物特异性要求较高,需进行熔解曲线分析;灵敏度相对较低。应用于基因的差异表达分析,比如RNA干扰效果确认。
TaqMan 探针法荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上,具有高度特异性,重复性好,荧光信号强。只适合一个特定的目标,探针价格较高。通常应用于基因拷贝数的确定,在临床诊断中最常用,比如病毒和病原菌定量检测。

技术应用

定量方法原理技术应用
绝对定量(Absolute Quantification,AQ)是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。病原体检测;转基因食品检测;基因表达研究。
相对定量(Relative Quantification,RQ)测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。基因在不同组织中的表达差异;药物疗效考核;耐药性研究。

实验流程

荧光实时定量PCR
实物数据信息实验周期
客户提供样本靶基因NCBI登录号4周
我们提供基本实验步骤、EXCEL原始数据扩增线,溶解曲线

实验结果展示

1)目的基因          

荧光实时定量PCR

2)内参基因

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3)柱形图

荧光实时定量PCR

图 4.3  A、B 两种细胞经加药处理后目的基因在各个时间点的qPCR相对定量表达量检测

1)目的基因的扩增曲线与熔解曲线;2)内参基因的扩增曲线与熔解曲线 ;

3)目的基因在 A、B 两种细胞加药处理后各个时间点的表达量柱形图(2-ΔΔCt相对定量数据处理)。

扩增曲线和溶解曲线的常见术语:

基线Baseline在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即称为基线。
荧光域值Threshold Value一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是3-15个循环荧光信号标准差的10 倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
Ct 值Threshold Cycle扩增产物的荧光信号进入指数增长期时所经历的循环数。模板的Ct值与起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct 值越小。
熔解曲线Tm值Tm Of Melting CurveSYBR Green染料发实验结束后需对qPCR产物加热,随着温度的升高,双链接扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降,将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同,从而可对PCR的特异性进行鉴定。

TROUBLESHOOTING

实验问题原因推荐解决方法
Ct 值起跳过晚引物设计不佳重新设计引物,RT—PCR摸索好扩增条件。
扩增效率低降低退火温度,适当提高镁离子浓度;PCR产物长度控制在100bp左右;荧光染料未降解。
模版量低增加反应循环数,提高模版量。
无Ct 值起跳引物设计不佳重新设计引物,RT—PCR摸索好扩增条件。
模板量低增加反应循环数,提高模板量。
熔解曲线出现双峰?非特异性扩增条带优化PCR反应条件,如提高退火温度,降低镁离子浓度;若优化失败需重新设计引物。
引物二聚体降低引物浓度或重新设计引物。
基因组污染抽提获得的RNA用DNase I消化基因组DNA后进行后续实验。

常见问题FAQ

Q:qPCR与普通PCR的区别是什么?

名称特点
普通PCR在PCR反应结束后对终点产物进行电泳定量分析,误差较大。
qPCR实时检测PCR扩增过程,在扩增的指数期对起始模板量进行定量分析,重复性好,误差小。

Q:请问进行相对定量检测前提供组织样本时需要将组织块定量吗?

A:不需要,采用qPCR相对定量法主要是以表达量稳定的内参基因作为对照从而判断目的基因相对表达丰度。我们在实验操作中会对各个环节进行把控,确保实验结果的客观性:1)组织抽提的RNA会进行定量;2)正式上机前对样本进行RT-PCR检测确定反应条件;3)上机检测后的相对定量数据分析,计算每个样本目的基因对相对稳定的内参基因的表达差异,可以排除上样量的差别对数据分析的影响。

Q:可以进行miRNA的荧光定量PCR检测服务吗?与编码基因的qPCR操作流程上有何区别?  

A:可以,采用专用的miRNA荧光定量PCR试剂盒即可。与编码基因的qPCR检测流程上的主要区别是需要将提取后的RNA,用poly(A) 聚合酶在其3’末端加尾,再用5’端带40nt延伸序列的单碱基锚定Oligo-dT引物进行反转录,得到约80nt的cDNA,然后用特异引物进行SYBR  Green实时定量PCR扩增。其中miRNA的引物设计需要大量摸索,才能获得重复性高可信度高的数据。

Q:如何制备绝对定量 PCR 的标准品?

A:将欲定量基因的一小段序列(200-300bp)克隆到T载体上,经测序验证后,进行小量抽提,采用分光光度计定量,按照公式计算拷贝数后梯度稀释,用于上机绘制标准曲线,从而计算待检测基因的拷贝数多少。

Q:荧光定量PCR有哪些注意要点?

A:荧光定量PCR的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase

free的操作,抽提的RNAOD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高,进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现,尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增。另外,还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定,退火温度在55-65° C之间。除此之外,其他各个环节如试剂的稳定性,RNA反转的质量好坏,PCR上机条件的设定,加样的手法和熟练度等等也要注意。

Q:荧光定量PCR引物的设计原则是什么?

A:1)扩增产物长度在80-200bp;引物应在核酸序列保守区内设计并有特异性;引物通常设计为跨内含子。

2)产物不能形成二级结构;引物长度在18-30bp之间,其中碱基应随机分布;待扩增的片段Tm值应在55-65°C之间;待扩增的片段GC含量在40-60%之间;引物自身及引物之间不能有连续4个碱基的互补。

3)引物5′端可进行修饰,3′端不能进行修饰; 引物3′端要避开密码子的第3位。

Q:如何设计荧光定量PCR的TaqMan探针?

A:TaqMan探针的设计原则为尽量靠近上游引物;长度一般为30-45bp,Tm 值至少比扩增引物高 5° C;5′端不能为 G,因为 G 会淬灭荧光,从而影响定量;设计时,需要通过软件来进行设计,网络上有许多免费的以及在线的设计软件可以使用。

Q:可否设计羊源、猪源等其他物种基因的qPCR引物?

A:可以设计,但对于人,大鼠,小鼠常规模式生物以外的基因(由于无法在NCBI获得完整的基因序列信息),在进行PCR优化的时候难度远远大于常规生物基因,周期会增加,且可能需设计多对引物才可能获得满意的实验结果。

Q:判断扩增曲线是否良好的指标有哪些?

A:1)曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显。

2)曲线指数期斜率与扩增率成正比,斜率越大扩增效率越高。

3)标准的基线平直或者略微下降,无明显的上扬趋势。

4)各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。

参考文献

  1. Livak KJ, Schmittgen TD.  Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001,25:402–408.
  2. Michael A. Innis,David H. Gelfand,John J. Sninsky. PCR Applications: Protocols for Functional Genomics. Academic.

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