腺病毒包装

腺病毒包装

adenovirus

实验原理

腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒(见图3.1),可迅速感染分裂和非分裂期细胞,与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞,在细胞核孔附近聚集,并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造,保留包装信号序列,去除病毒蛋白的编码序列,不仅增加外源基因的装载容量,而且降低细胞毒性和机体免疫反应,从而获得安全性更高的基因导入系统。

腺病毒包装系统的特点:不整合到宿主细胞基因组,无插入致突变性;可进行有效扩增,获得高滴度高纯度的腺病毒。

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图3.1腺病毒结构示意图

技术应用

体外实验可快速有效地将目的基因或RNAi片段导入靶细胞,研究目的基因功能。

体内实验多应用于疫苗接种、基本治疗研究等。

实验流程

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病毒提供规格

腺病毒种类客户提供我们提供的病毒规格提供量赠送阴性对照实验周期
过表达腺病毒基因NCBI登陆号及含该基因的质粒载体、测序报告低滴度10^8-10^9 IU/ml10ml2ml6周
高滴度10^11-10^12 IU/ml1ml0.2ml9周
高纯滴度10^11-10^12 IU/ml(推荐用于动物体内实验)1ml0.2ml10周
干扰腺病毒待干扰基因的NCBI登陆号及靶点序信信息低滴度10^8-10^9 IU/ml10ml2ml7周
高滴度10^11-10^12 IU/ml1ml0.2ml10周
高纯滴度10^11-10^12 IU/ml(推荐用于动物体内实验)1ml0.2ml11周

载体图谱

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            图3.2第一次重组腺病毒中间载体图谱                             图3.3第二次重组腺病毒载体图谱

实验结果展示

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图3.4过表达腺病毒感染原代大鼠神经元细胞图片及qPCR过表达检测

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图3.5腺病毒感染各种细胞图片展示

TROUBLESHOOTING

实验问题原因推荐解决方法
过表达基因的腺病毒进行包装后得率很低?包装细胞状态不佳请选择状态良好,代数较早的293细胞。
目的基因片段过长对于3000bp以上的基因建议不要增加IRES-EGFP标记,并在后续实验增大皿数。
腺病毒扩增后得率很低?病毒原液质量不佳或滴度过低适当扩增一两代后再进行大扩。
带有 EGFP 荧光标记的腺病毒感染细胞后无荧光表达框不正确确认外源基因与 EGFP 的表达框是否无误
细胞状态不佳确认细胞状态良好,并摸索合适的MOl植。
带有 EGFP 荧光标记的腺毒感染目的细胞后无荧光很弱?目的基因片段过长片段过长影响共表达的EGFP荧光,建议观察GFP阴性对照腺病毒的感染效率。
细胞状态不佳确认细胞状态不好,并摸索合适的MOl值。
过表达基因的腺病毒感染目的细胞后WB检测过表达不明显?表达框不正确确认过表达基因的腺病毒载体表达框正确,未发生提前终止。
细胞状态不佳确认细胞状态良好,并摸索合适的MOI值。
干扰腺病毒感染靶细胞后qPCR检测干扰效果不佳?未经验证的干扰靶点确认靶点是否经过验证,若无效需重新设计干扰靶点
细胞状态不佳确认细胞状态良好,并摸索合适的MOI值。

常见问题 FAQ

Q: 客户提供 RNAi 靶点进行腺病毒包装要注意哪些要点?

A:客户提供的 RNAi 靶点序列,需明确该靶点在靶细胞的 RNAi 效率是否经过客户验证。如果是客户从文献

中查询到的 shRNA 干扰靶点序列,其在靶细胞的干扰效率能否达到客户要求具备一定风险,建议可进行小量

包装验证后再进行大量包装实验。若客户无法提供 RNAi 靶点,建议客户在我公司进行 RNAi 靶点的设计和筛

选工作,将筛选得到的最佳靶点进行腺病毒包装工作。

Q :腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?

A:有要求。一般基因长度超过 3000bp 的基因在载体重组过程中难度已经加大,且会影响腺病毒的出毒效率。

Q:腺病毒发货前进行哪些质检工作?

A:发货前我们会对腺病毒的滴度进行检测,采用的方法为 TCID50 方法(单位为 TCID50/ml),严格按照客户的要求的滴度进行发货;对于过表达目的基因的腺病毒,我们会将其感染 293 细胞,qPCR 检测过表达目的

基因的表达丰度。

Q : TCID50 法检测腺病毒滴度的操作过程及周期?

A:96 孔板中接种 293 细胞后,用 DMEM 将病毒液稀释成 8 个浓度(如 10-3-10-10),每个浓度重复 10 孔,每孔加入病毒稀释液 100μl,37℃培养 10 天,观察细胞,根据细胞病变率计算滴度值。注意滴度检测操作时间长, 需要感染病毒后 10 天才能观察和计算结果 , 需客户耐心等待准确的滴度测定结果。

Q:腺病毒的单位 VP、PFU 和 IU 各是何含义?

A:VP:病毒颗粒数(viral particle),是具备感染能力和不具备感染能力的腺病毒颗粒的总量。

PFU:空斑形成单位(plaque formation unit),是有感染能力的腺病毒的总量,即腺病毒的活性单位。

IU:感染单位(infectious unit),是腺病毒活性单位,测定方法是TCID50法。

Q : 订制的腺病毒产品接收后如何保存和使用?

A:我们采用干冰特快专递方式递送到客户手中。客户收到后,应注意以下几点:

1)确认泡沫塑料盒中的干冰仍有剩余,冰盒内保持低温;2)确认泡沫塑料盒内物品与发货样本清单一致,腺病毒产品包装完整,没有破碎、渗漏;3)公司提供分装好的腺病毒产品,短时间内不使用请冻存于 -80℃超低温冰箱中。半年内使用完毕。4)冻存于 -80℃超低温冰箱中的腺病毒产品使用前取出,后在室温下解冻,解冻后放在冰浴中,并尽快使用。如果解冻后的病毒暂时用不完,滴度足够高时(比如 1011~12TCID50/ml),4℃可保存 1~2 周。5)若每次用量很少,可对腺病毒进行分装。

Q 包装好的病毒在使用中要注意哪些安全性问题?

A:腺病毒的使用要求在生物安全标准 2 级 (BL2) 的实验室进行,操作人员穿工作服、戴口罩及一次性乳胶手套。操作时应在指定的区域内使用 II 级生物安全柜;操作时动作尽量轻柔,避免产生气溶胶和飞溅;含有腺病毒的废液和用具可用 121℃高压灭菌 30 分钟;使用锐器(如注射器、刀片)时务必要小心。

Q : 腺病毒可以浓缩或稀释吗?方法如何?

A:可以浓缩:浓缩后的滴度以不超过 3×1012v.p/ml 为宜,过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释:可采用PBS、生理盐水、DMEM等进行稀释,稀释后的样品尽量一次用完,在没有保护剂的情况下,腺病毒在 2 ~ 8℃保存时间不能超过一周。

Q :用于体内试验的腺病毒,是否要求纯化?

A:体内实验腺病毒纯化是很必要的:因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒 fiber 和 penton 蛋白(细胞毒素)、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内,会引起宿主强烈的免疫反应。另外,纯化的作用还可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中。

Q :小鼠体内注射腺病毒,一只小鼠大概需要多少量?腺病毒对小鼠的半数致死剂量(LD50)大概是多少?

A:我们建议的腺病毒用量范围在 108-10IU/ 只小鼠,客户需进行预实验摸索正确的使用剂量。小鼠肌注腺病毒后,3~4 天目的蛋白的表达达到高峰,一周后逐渐下降,持续表达时间在两周左右。静脉注射小鼠(昆明鼠),半数致死剂量 LD50 大约为 1×1011v.p./ 只;裸鼠和 SCID 鼠(严重联合免疫缺陷小鼠)可能更敏感一些。肌注方式的 LD50 未测到:1×1012v.p./ 只给药,未发现小鼠死亡。

Q :可以更换特异性启动子后进行腺病毒包装吗?

A:可以。常规采用 CMV 启动子可以获得理想的表达,若需要采用特异性启动子进行腺病毒包装,建议验证该启动子介导的表达效率后,再进行腺病毒特异性启动子载体的构建及包装工作。

参考文献

1. Kozarsky, K. F., and Wilson, J. M. (1993). Gene Therapy: Adenovirus Vectors. Curr. Opin. Genet. Dev. 3,

2.Russell, W. C. (2000). Update on Adenovirus and its Vectors. J. Gen. Virol. 81, 2573-2604.

3.Wang, I. I., and Huang, I. I. (2000). Adenovirus Technology for Gene Manipulation and Functional Studies. Drug

Discovery Today 5, 10-16.

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