目的基因ORF克隆
ORF cloning
实验原理
ORF 克隆是指从样本组织或细胞中抽提总 RNA，反转录，设计合成特异性引物后，通过 RT-PCR 扩增获得目的基因的 DNA 序列，获得编码全长蛋白质序列的 DNA 序列：即从起始密码 ATG 到终止密码子，不含 5′或 3′UTRs 非翻译区）及内含子序列。
技术应用
目的基因的表达研究
基因、蛋白的功能研究
实验流程
| 实物 | 数据信息 | 实验周期 | |
| 客户提供 | 目的基因表达丰富高的组织或细胞样本 | 目的基因NCBI登录号 | 4周 |
| 我们提供 | 质粒/菌株 | 基本实验步骤、电泳图片、测序报告 |
实验结果展示
A B C
图1 目的基因的ORF克隆实验结果
A:样本1和样本2的RNA抽提电泳结果 ；B 不同扩增条件下目的片段的PCR扩增结果；C 目的片段酶切鉴定结果（T载体片段2692bp，目的片段1100bp）。
TROUBLESHOOTLNS
| 实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 | |
| RT-PCR 未能扩增得到目的条带？ | RNA 的抽提质量 | 严格按照标准RNA的抽提步骤进行 | |
| 基因表达丰度 | 目的基因的本底表达丰度是否过低，考虑更换表达丰度更高的组织细胞样本。 | ||
| 复杂基因结构 | 基因序列中存在复杂的二级结构，GC 含量过高，串联重复序列都可能导致扩增失败。 | ||
| RT-PCR 扩增非特异性条带过多？ | PCR 反应条件 | 建议提高退火温度 | |
| RT-PCR 扩增目标带过弱？ | PCR 反应条件 | 建议增加 DNA 聚合酶的量或镁离子浓度 |
常见问题FAQ
Q：我怎样获得含有母的基因序列的质粒呢？
A :明确目的基因的种属和基因的 NCBI 登录号后，如果想通过调取的方式获得则需要了解该基因在哪些组织或细胞中表达丰度较高，即通过 ORF 克隆获得蛋白翻译序列，然后构建至质粒中；若基因表达丰度低，难于调取可以考虑通过化学合成，即合成长片段引物，分段扩增拼接得到全长序列，然后构建至质粒中。
Q : ORF 克隆服务若需客户提供材料需要哪些注意事项？
A :通常我们可从公司的常见肿瘤细胞和正常组织的 cDNA 库进行调取工作。若客户提供高表达目的基因的特定组织或细胞，请注意实验材料必须保证新鲜，即采样后需立即放入液氮中速冻或研磨加Trizo保护液，保证RNA 无明显降解，组织样本提供总量大于 50mg，细胞样本总量大于 1*10^5。
Q:收到的质粒和菌株如何保存？
A:收到的质粒和菌株如需长期保存请置于 -80 ℃，菌株活化可以通过平板划线后，挑取单克隆过夜摇菌。一般质粒较菌株更加稳定，若菌株已无法活化，可以将质粒转化大肠杆菌，重新保存菌株，并可以抽提更多质粒以进行后续的实验工作。
Q: cDNA 克隆与 ORF 克隆的区别是什么？
A:cDNA克隆比ORF克隆多了5′或3′UTRs序列。注意5’UTR序列可能会形成复杂二级结构，影响基因的表达效率，因此一般采用 ORF 克隆进行表达研究。
Q:调取出来的序列与NCBI上相同基因名称的序列比对时，发现两者间有一定程度上的差异，如何解释？
A:由于编码基因的多选择性剪接，一个基因通常会有多个转录产物（通常是长短的差异），因此可通过文献确定最具有代表性的转录本；另外由于调取样本的来源导致的基因遗传多态性，会出现一些有义或无义的突变。我们可以通过比较多个克隆的测序结果确认这些突变并非是由于 PCR 引入的。如果酶的保真度出现问题，出现的点突变会是随机发生的，不可能在每个克隆的同一位点发生相同的突变。无义突变不会影响蛋白的翻译序列，一般可以接受。若怀疑有义突变会影响到蛋白功能就需要进行突变修复工作。
参考文献
1. Joseph Sambrook, E. F. Fritsch,Tom Maniatis. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
2. Benjamin Lewin. Genes lx [M]. Pearson Education,2017.
