流式凋亡检测

流式凋亡检测

apoptosis detection

实验原理

细胞凋亡(Cell apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下的损伤,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡检测的方法很多,我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理:磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针。(如下图7.4所示)。

流式凋亡检测

图7.4 Annexinv检测细胞凋亡的原理

碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞,而使细胞核红染。Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡,可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。

技术应用

细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。

实验流程

流式凋亡检测
实物数据信息实验周期
客户提供细胞株(冻存株或培养细胞)及所需药品细胞培养信息和药物处理方式3周
我们提供剩余药物基本实验步骤、细胞培养照片、流式上机图片、数据分析结果

实验结果展示

流式凋亡检测

图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

TROUBLESHOOTING

实验问题原因推荐解决方法
空白细胞凋亡率高?操作不当操作动作轻柔,收完样后尽快上机。
检测试剂量过大,信号过强降低试剂用量。
采用Annexin V/PI双染法检测凋亡诱导后的阳性对照样本凋亡率偏低?试剂盒过期4℃保存时间不要超过半年。
荧光淬灭操作过程中注意避光,加完染料之后最后在2h内检测。
丢弃细胞培养上清细胞培养上清中含有漂浮细胞,丢弃后造成凋亡比例偏低。

常见问题FAQ

Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?

A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。

Q :常见的细胞凋亡检测方法及优缺点比较?

方法优点缺点
Anexin VPI双染法:Annexin v可结合凋亡细胞外翻的PS蛋白。可以准确的进行凋亡细胞的计数。反应完毕后需在一小时内检测,贴壁细胞吹打处理要轻柔,防止机械损伤对实验结果的影响。不能用于组织样本。
Sub G1 峰检测:凋亡细胞DNA含量的流式细胞计划分析,分析DBA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。适用性广,操作方便。对实验操作及实验结果的分析能力要求较高。不能用于组织样本。
TUNRL法:染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘ -OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,对DNA的3’ 末端进行荧光剂标记。原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,特别适用于组织样本的凋亡研究。操作要求高,组织样本需要固定,固定方式不好可能导致背景高、信号弱。
Caspase等凋亡通路蛋白的WB检测:未活化前以酶原形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段被剪切激活,可裂解相应的胞浆、胞核底物,最终导致细胞凋亡。WB检测方便快捷,实验结果相对直观,可进行半定量检测。注意购买质量好的抗体并优化检测条件。

Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?

PIAnnexin V代表细胞群
LL象限正常细胞
LR象限+早期凋亡细胞
UR象限++晚期凋亡细胞或者坏事细胞
UL象限+理论上不会出现细胞;若出现有可能是操作过程中受到损害的细胞或是FACS仪器参数设置不当

A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色荧光(Annexin V为FITC绿色荧光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。

流式凋亡检测

图7.6流式四象限图

Q:流式上机检测细胞凋亡每次所需要的细胞量大概是多少?

A:靶细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需要10^5-10^6个细胞。

参考文献

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.

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